La Biblioteca, ubicada en el ala sudeste del edificio, fue creada por Julio Marc para profundizar las investigaciones de la colección del Museo. Tanto sus fondos bibliográficos como documentales están a disposición de investigadores, profesores, estudiantes y especialistas en general.
Entre los más de 12.000 ejemplares de documentos anteriores a la conquista de América hasta los fechados a mediados del siglo XX, se encuentran legajos del gral. José de San Martín, Manuel Belgrano, Juan Manuel de Rosas, Justo José de Urquiza. También se albergan las primeras escrituras del Pago de los Arroyos, prensa de los siglos XIX y XX, fotografías de la ciudad de Rosario y mapas de la región. En tanto, la biblioteca donada por el ingeniero Augusto Fernández Díaz, especializada en libros de viajeros, genealogía e historia de Rosario, es uno de los repositorios de fondos bibliográficos antiguos de los siglos XVI a XVIII más importante del país.

Asimismo, la hemeroteca cuenta con colecciones significativas en la historia nacional: “Gaceta de Buenos Aires”, “El Telégrafo Mercantil”, “Correo de Comercio”, “El Censor”. Además, de revistas y periódicos satíricos como “Fray Mocho”, “Don Quijote”, “Caras y Caretas”, “El Mosquito”, “La presidencia”, “El Látigo”. También incluye la colección del diario “La Capital” y “La Tribuna”.

En la mapoteca, se conservan mapas antiguos de Sudamérica y Argentina y primeros planos de Rosario.

Entre los materiales de la historia local, que representan el mayor caudal seriado de la biblioteca, pueden destacarse:

- Escrituras públicas del Rosario de 1689 a 1869. (Digitalizadas y microfilmadas).
- Archivo General del Departamento Rosario, causas civiles, comerciales y criminales entre 1735 y 1886.
- Archivo de la Jefatura Política de Rosario entre 1852 y 1894.
- Archivo Pablo Ricchieri.
- Archivo de fotografías antiguas de la ciudad de Rosario y de la Provincia de Santa Fe desde 1866. (Álbum Alfeld).

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